【Photonics】2014諾貝爾化學獎 - STED Nanoscopy 受激放射消去顯微法

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Diffraction Barrier 繞射極限

繞射極限

1. 通過圓孔（即透鏡）的光波繞射，對任何遠場成像系統的解析度有所謂的限制或極限。
2. 自從一個多世紀以前(1873年)由安斯特·阿貝（Ernst Abbe）發現以來，繞射極限就一直是眾所周知的。更實際地說，在（共焦）顯微鏡中解析附近物體的能力受到物鏡產生的焦點大小的限制。

Lateral 橫向解析度

1. Abbe’s equation：∆𝑟≈𝜆/2𝑁𝐴
2. NA：Numerical Aperture，即數值孔徑

   • 系統可接受或入射光的角度範圍

   • NA=nSinϴ

     

Axial 軸向解析度

1. Axial：∆𝑧≈𝑛𝜆/〖𝑁𝐴〗^2
2. 通常軸向解析度為橫向解析度 2 ~ 3 倍

簡單計算繞射極限

假設使用可見光(400nm的最短波長)、高NA(趨近於1)物鏡，代入Abbe’s equation

1. 橫向解析度：200nm
2. 軸向解析度：400~600nm
3. 從上述可知傳統的顯微鏡 (e.g.共焦顯微鏡) 在奈米尺度下的解析度非常差

STED Nanoscopy 受激放射消去顯微法

STED 簡介

1. STED：Stimulated emission depletion 受激放射消去顯微法

2. point-scanning microscope，點掃描顯微鏡，
   簡單來說就是用一個奈米大小的手電筒掃描樣品

3. 焦點大小 極小

4. No Post-Processing required，直接可以觀察影像，不必後期處理、分析

5. 在Depletion laser的光路中加入，Phase Modulator，使其形狀變成甜甜圈形。
   入射光束的這些相位延遲疊起來的結果使得聚焦的光在聚焦中心中破壞性地干涉

   

6. STED的掃描方式

   • STED顯微鏡固定：以調整焦距的方式，掃描sample，耗時短
   • STED顯微鏡可移動：一個點一個點掃描sample，耗時長

STED v.s. Confocal(共焦顯微鏡)

1. Confocal(A圖)：傳統的共焦顯微鏡中，激發源（通常是laser）被聚焦到繞射極限點，成為用熒光標記的樣品，然後在相同的焦點區域產生熒光。
2. STED(B圖)：加入depletion將熒光限制在sub-diffraction的尺度

STED能階圖

1. 激發，熒光和抑制的基態和激發態之間的熒光躍遷。
2. depletion laser將熒光團從激發態強制抑制回基態時，通過有針對性的切換實現解析度的提高。

depletion 消去

1. B圖為橫向的depletion laser輪廓
2. C圖為軸向的depletion laser輪廓
3. depletion的焦點必須適當地成形，以便這種開/關切換產生sub-diffraction大小的焦點。
4. On：exciting
   Off：quenching 熒光淬滅

Conclusion 結論

1. STED顯微鏡的解析度被認為是沒有繞射極限，實際上，除標准考慮因素（如標記特異性，背景信號，光學像差和信噪比）之外，實際獲得的解析度還要取決於熒光團和樣品對laser的容限強度。
   • 超過樣品的容限強度可能會發生光漂白，也就是一種對螢光團的光化學破壞。
   • 所以目前STED解析度極限大約在數奈米~10奈米左右
2. STED的解析度增強是一種純粹的物理現象，不需要採集後的圖像分析。
   結果，可以即刻觀察獲取的圖像（如同使用傳統的雷射掃描或寬場顯微鏡）。
3. 超解析度
   • 過去沒有STED這種奈米尺度的解析度，用共焦顯微鏡所做的研究可能會有錯誤。
   • 找出以前沒有發現的結構或性質
4. 2014諾貝爾化學獎 - STED：Stefan Hell, William Moerner 和 Eric Betzig

Reference 參考資料

1. Neuro at the Nanoscale：Diffraction-Unlimited Imaging with STED Nanoscopy
   http://journals.sagepub.com/doi/full/10.1369/0022155415610169
2. NA：https://en.wikipedia.org/wiki/Numerical_aperture
3. STED Nanoscopy：https://en.wikipedia.org/wiki/STED_microscopy
4. Phase Modulator：https://svi.nl/STEDMicroscopy
5. STED影片：https://www.youtube.com/embed/B4m_Y747gzw